tutoral
Hoy fué mi tutoral, no me quejo y pecando de soberbio he de decir que me fué bien como siempre. Como siempre tiendo a exponer muy rollero y eso luego deriva en falta de claridad y en la ciencia eso no es bueno pues dificulta la interpretación de los datos. Lo bueno es que cada vez sucede con menor intensidad así que por lo menos lo voy solucionando.
Los resultados fueron bien recibidos una vez que me entendieron; el modelo se ve fortalecido y solo es cosa de seguir un camino bien definido para concluir el proyecto así que ando entre tenso y emocionado teorizando cuales serán los resultados. Lo bueno es que tiempo sobra, mi doctorado termina en un año oficialmente pero me puedo hechar otros seis meses en lo que publican el paper así que todavía andaré por aquí hasta el siguiente diciembre.
Mi purificación está en un punto extraño, mis intentos de purificar por filtración en gel resultaron en vano, simplemente mi proteína tetrameriza o multimeriza y se sale con el frente de la columna. Por lo pronto jugaremos mas con el intercambio iónico que ya nos ha funcionado cambiando condiciones como el pH del buffer o el intercambiador para ver si podemos limpiarla aún mas. Una tercera opción es la hydroxyapatita pero esa está en veremos. El lado positivo de tantos intentos es que por lo menos ahora manejo practicamente todas las técnicas de cromatografía de proteínas que hay, si al final no se puede hay otros métodos menos elegantes pero mas eficiente que podemos intentar.
Lo que si hice con mi proteína parcialmente pura fué probar su interacción con DNA, mis geles de retardo fuerón laboriosos de montar pero ahora los dominó perfectamente. Imaginen que tienen un fragmento de DNA y lo ponen en una gelatina si aplican corriente eléctrica la molécula migrará a travez de esta a una velocidad determinada por su tamaño (esto se llama electroforesis) ahora imaginen que ponen ese mismo fragmento pero que tiene una proteína pegada, esto incrementa su tamaño disminuyendo si velocidad de migración. Así una molécula libre llegará mas lejos que una que tiene una proteína pegada, de eso se tratan mis experimentos. El DNA se marca con radioactividad así que son medio delicados de hacer pero los resultados se ven muy bonitos.
Se acuerdan de las mutantes malditas? pues ya revisé su fenotipo y tenemos un exito absoluto, ustedes no están para saberlo pero si una de las mutantes mantenía la transferencia podíamos mandar mi proyecto directo al bote de la basura. Afortunadamente podemos vivir tranquilos ya que la mutante efectivamente perdió la conjugación. 2 años de trabajo por fin fueron coronados con el éxito!
El aparato que pongo aquí es un HPLC (cromatografía líquida de alta presión, aunque para algunos la p significa otra cosa). El equipo con todos sus aditamentos y columnas costó 80000 dolaritos. Pagando ese precio uno esperaría que la compañía te mandara 7 ingenieros, dos químicos y un físico a instalarlo. EN realidad mandaron a un par de ingenieros mal preparados que han sido incapaces de instalarlo desde hace dos semanas, es increíble esa incapacidad y falta de seriedad en el representante de BioRad en México. Que tristeza y que verguenza.
Los resultados fueron bien recibidos una vez que me entendieron; el modelo se ve fortalecido y solo es cosa de seguir un camino bien definido para concluir el proyecto así que ando entre tenso y emocionado teorizando cuales serán los resultados. Lo bueno es que tiempo sobra, mi doctorado termina en un año oficialmente pero me puedo hechar otros seis meses en lo que publican el paper así que todavía andaré por aquí hasta el siguiente diciembre.
Mi purificación está en un punto extraño, mis intentos de purificar por filtración en gel resultaron en vano, simplemente mi proteína tetrameriza o multimeriza y se sale con el frente de la columna. Por lo pronto jugaremos mas con el intercambio iónico que ya nos ha funcionado cambiando condiciones como el pH del buffer o el intercambiador para ver si podemos limpiarla aún mas. Una tercera opción es la hydroxyapatita pero esa está en veremos. El lado positivo de tantos intentos es que por lo menos ahora manejo practicamente todas las técnicas de cromatografía de proteínas que hay, si al final no se puede hay otros métodos menos elegantes pero mas eficiente que podemos intentar.
Lo que si hice con mi proteína parcialmente pura fué probar su interacción con DNA, mis geles de retardo fuerón laboriosos de montar pero ahora los dominó perfectamente. Imaginen que tienen un fragmento de DNA y lo ponen en una gelatina si aplican corriente eléctrica la molécula migrará a travez de esta a una velocidad determinada por su tamaño (esto se llama electroforesis) ahora imaginen que ponen ese mismo fragmento pero que tiene una proteína pegada, esto incrementa su tamaño disminuyendo si velocidad de migración. Así una molécula libre llegará mas lejos que una que tiene una proteína pegada, de eso se tratan mis experimentos. El DNA se marca con radioactividad así que son medio delicados de hacer pero los resultados se ven muy bonitos.
Se acuerdan de las mutantes malditas? pues ya revisé su fenotipo y tenemos un exito absoluto, ustedes no están para saberlo pero si una de las mutantes mantenía la transferencia podíamos mandar mi proyecto directo al bote de la basura. Afortunadamente podemos vivir tranquilos ya que la mutante efectivamente perdió la conjugación. 2 años de trabajo por fin fueron coronados con el éxito!
El aparato que pongo aquí es un HPLC (cromatografía líquida de alta presión, aunque para algunos la p significa otra cosa). El equipo con todos sus aditamentos y columnas costó 80000 dolaritos. Pagando ese precio uno esperaría que la compañía te mandara 7 ingenieros, dos químicos y un físico a instalarlo. EN realidad mandaron a un par de ingenieros mal preparados que han sido incapaces de instalarlo desde hace dos semanas, es increíble esa incapacidad y falta de seriedad en el representante de BioRad en México. Que tristeza y que verguenza.
Buenas Nuevas
Pues este semestre empezó raro, con algunas cosas saliendo después de mucho tiempo y otras no saliendo para nada.
He repetido mis ensayos de retardo mejorando el marcaje del DNA y añadiendo EDTA para inhibir las DNAsas que pudieran estar digiriendolo. El resultado ha sido un exito rotundo e incluso mi control negativo se ve igual a mi DNA libre (primeros dos carriles a la izquierda) y las muestras con mi fracción parcialmente pura (ultimos 4 carriles) muestran un retardo indiscutible. Lo único discutible es que el retardo se da en ambas regiones regulatorias que es un resultado inesperado. En fin, esa especificidad la voy a probar cuando tenga una fracción mas pura de mi proteína.
La estrategía a seguir en esta purificación fué discutida esta semana con Otto. Hemos decidido dos vías una es hydroxyapatita con el plus de que tendría que prepararla asunto que se me antoja mucho. Sin embargo todavía estamos tratando de determinar la receta que vamos a usar. La segunda opción es una exclusión en Sephadex G75. Ya había yo hecho una exclusión antes con sephadex G50 y mi proteína se había salido por el frente, por eso nos subimos a Sephadex G75 y además ahora vamos a usar una columna de 100 cm a diferencia de la pasada de 53. Hoy vacié la columna, la primera vez me quedó en escalera y con ayuda de Mildred (la otra estudiante de mi tutor) la tuve que deshacer. La segunda vez me quedó bien bonita y la estuve equilibrando toda la tarde. Ya está lista y si todo sale bien esta semana tendré una fracción pura de mi proteína, si no es así me tendré que conseguir un caldero para preparar hydroxyapatita.
Por último ya obtuve la mutante no polar en yp037, ya hice cruzas con la esta y la no polar y aunque todavía no se ven las donadoras si se ve claramente que la polar si tiene transconjugantes mientras que la no polar NO!!!!!! excelentes noticias. Falta una semana para el tutoral y todo va saliendo bien