Buenas Nuevas
Pues este semestre empezó raro, con algunas cosas saliendo después de mucho tiempo y otras no saliendo para nada.
He repetido mis ensayos de retardo mejorando el marcaje del DNA y añadiendo EDTA para inhibir las DNAsas que pudieran estar digiriendolo. El resultado ha sido un exito rotundo e incluso mi control negativo se ve igual a mi DNA libre (primeros dos carriles a la izquierda) y las muestras con mi fracción parcialmente pura (ultimos 4 carriles) muestran un retardo indiscutible. Lo único discutible es que el retardo se da en ambas regiones regulatorias que es un resultado inesperado. En fin, esa especificidad la voy a probar cuando tenga una fracción mas pura de mi proteína.
La estrategía a seguir en esta purificación fué discutida esta semana con Otto. Hemos decidido dos vías una es hydroxyapatita con el plus de que tendría que prepararla asunto que se me antoja mucho. Sin embargo todavía estamos tratando de determinar la receta que vamos a usar. La segunda opción es una exclusión en Sephadex G75. Ya había yo hecho una exclusión antes con sephadex G50 y mi proteína se había salido por el frente, por eso nos subimos a Sephadex G75 y además ahora vamos a usar una columna de 100 cm a diferencia de la pasada de 53. Hoy vacié la columna, la primera vez me quedó en escalera y con ayuda de Mildred (la otra estudiante de mi tutor) la tuve que deshacer. La segunda vez me quedó bien bonita y la estuve equilibrando toda la tarde. Ya está lista y si todo sale bien esta semana tendré una fracción pura de mi proteína, si no es así me tendré que conseguir un caldero para preparar hydroxyapatita.
Por último ya obtuve la mutante no polar en yp037, ya hice cruzas con la esta y la no polar y aunque todavía no se ven las donadoras si se ve claramente que la polar si tiene transconjugantes mientras que la no polar NO!!!!!! excelentes noticias. Falta una semana para el tutoral y todo va saliendo bien